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大连微网站,家居企业网站建设教程,嘉定建设机械网站,做坑人网站二维码大豆是全球重要的油料作物#xff0c;提供27%的植物源性油脂#xff0c;但随着食品和生物燃料需求增长#xff0c;亟需通过遗传改良提高油含量#xff08;预计未来30年需翻倍#xff09;。尽管已知LAFL、WRI1等转录因子参与油脂积累#xff0c;但三螺旋转录因子家族在大豆…大豆是全球重要的油料作物提供27%的植物源性油脂但随着食品和生物燃料需求增长亟需通过遗传改良提高油含量预计未来30年需翻倍。尽管已知LAFL、WRI1等转录因子参与油脂积累但三螺旋转录因子家族在大豆中的功能尚不明确尤其缺乏对种子油含量调控的具体分子机制研究。东北农业大学的陈庆山团队赵莹副教授在期刊Journal of Integrative Plant BiologyIF9.3发表了题为“The GmGT-2F, a Trihelix transcription factor, regulates seed oil content by directly activating GmAGAL transcription in soybean”的研究论文。该研究阐明了转录因子GmGT-2F调控种子油含量的机制拓展了对三螺旋转录因子在种子品质性状调控中功能的认识并为优质大豆育种提供了新见解。爱基百客为该研究提供DAP-seq的技术支持。研究技术RNA-seq、DAP-seq、Y1H、EMSA等研究结果01 GmGT-2F的分子特征及表达分析研究对大豆三螺旋转录因子家族进行分析系统发育分析表明大豆三螺旋蛋白可分为六个亚家族GT-1、GT-2、GT-γ、GT-δ、SH4和SIP1图1A。GmGT-2FGlyma.03G246000属于GT-2亚家族。GT-2亚家族在不同组织和种子发育阶段的表达聚类分析将GT-2基因分为四个不同的簇。簇I基因主要在茎、根瘤和种子中表达簇II基因在种子发育过程中表现出阶段特异性表达簇III基因主要在叶片和成熟种子中表达簇IV基因在茎、叶和花中表现出高表达。RT-qPCR揭示了GmGT-2F的组织特异性和发育调控特征其在花和种子发育中后期特异性高表达图1C。GmGT-2F-GFP融合蛋白的亚细胞定位分析显示其与细胞核标记完全重叠证实了其核定位图1D。图1GmGT-2F编码一种三螺旋转录因子02 GmGT-2F可提高转基因大豆植株种子的含油量为了探究GmGT-2F在种子油脂和蛋白质含量中的调节作用研究构建了GmGT-2F敲除株系gmgt-2f-crgmgt-2f-1和gmgt-2f-2图 2A, B与过表达株系OE-2和OE-6图2C, D。种子的蛋白质含量分析和油脂含量分析显示GmGT-2F对大豆种子的蛋白质含量起负调控作用种子油脂积累的主要且直接的正调控因子种子脂肪酸谱的GC-MS分析表明GmGT-2F通过特异性提高油酸和亚油酸水平直接增加了种子含油量并调节了脂肪酸组成。透射电子显微镜观察了不同种子发育阶段的油体OBs和蛋白贮藏液泡PSVs图 2H。观察发现证实了GmGT-2F在大豆种子中起着正向调控油脂含量和负向调控蛋白质积累的作用。图2转基因大豆GMGT-2F基因敲除株系和转基因大豆GMGT-2F-OE株系的种子油和蛋白质含量分析03 GmGT-2F调控大豆种子大小与重量在成熟期评估了野生型、GmGT-2F-OE和gmgt-2f-cr的农艺性状图3AB。与野生型相比GmGT-2F-OE和gmgt-2f-cr株系的株高或单株荚数均未观察到显著差异。然而种子大小测量结果显示与野生型相比GmGT-2F-OE株系的种子长度和宽度显著减小而gmgt-2f-cr株系的种子尺寸则有所增加。百粒重和单株种子总重也观察到了类似的趋势即与野生型相比GmGT-2F-OE株系显著降低而gmgt-2f-cr株系则有所增加图3C。这些发现表明GmGT-2F在大豆中负调控种子的大小和重量。图3野生型WT、GmGT-2F-OE及gmgt-2f品系产量性状分析与OE-6及WT成熟种子转录组分析04 GmGT-2F下游靶基因的鉴定为鉴定GmGT-2F调控的基因研究对OE-6和野生型进行了RNA-seq。差异分析表明OE6中有259个基因显著上调935个基因下调图3E。KEGG富集分析表明这些DEGs与以下关键代谢通路相关内质网中的蛋白质加工、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、脂肪酸降解、α-亚麻酸代谢和脂肪酸生物合成图3F突显了它们与种子油脂和蛋白质生物合成的相关性。为了进一步鉴定GmGT-2F的直接结合靶标研究进行了DAP-seq分析。基因组定位表明这些峰分布在基因间区56.32%、内含子19.73%、CDS6.15%、5UTR3.37%、3UTR3.59%和启动子10.84%区域图 4A。富集概况显示在上游启动子和基因主体区域存在大量的结合事件图 4B。将RNA-seq中的上调基因与DAP-seq结果进行整合鉴定出了21个高可信度的GmGT-2F靶基因图 4C。此外KEGG通路分析表明Glyma.10G174500 (EC3.2.1.22) 参与了甘油酯和半乳糖代谢。注释和序列比对证实该基因编码一种 α-半乳糖苷酶命名为 GmAGAL图 S4它可能是GmGT-2F的下游靶标。图4GmGT-2F直接结合GmAGAL启动子并激活其转录05 GmGT-2F直接激活GmAGAL转录为了验证GmGT-2F与GmAGAL启动子的结合研究进行了酵母单杂交Y1H实验这表明GmGT-2F能特异性结合GmAGAL的启动子序列。双荧光素酶报告基因实验发现证明GmGT-2F是GmAGAL表达的正调控因子。DAP-seq分析揭示了GmAGAL启动子内存在两个假定的GmGT-2F结合基序分别位于相对于ATG起始密码子的-931 bp和-3,592 bp处。这些位点分别被命名为M1GAGAAGAC和M2AAGAAAAAAG图4G。EMSA显示图4HGmAGAL是GmGT-2F的直接转录靶点M1和M2是介导这种调控相互作用的关键顺式元件。为了进一步验证GmGT-2F在体内与GmAGAL启动子的特异性结合研究对GmAGAL启动子区域的M1和M2序列进行了突变并进行了双荧光素酶报告基因实验。结果表明GmGT-2F无法激活突变后的GmAGAL转录这为其特异性结合GmAGAL启动子提供了有力证据。06 GmGT-2F通过调控α-半乳糖苷酶活性促进油脂积累GmAGAL的组织特异性表达分析表明其表达量在种子发育过程中逐渐增加并在DS阶段达到峰值图5A这表明GmAGAL基因在大豆种子成熟过程中起着关键作用。亚细胞定位分析证实了GmAGAL定位于线粒体图5B。酶活检测证实了GmGT-2F正向调控α-半乳糖苷酶活性。为了研究GmAGAL在种子油脂合成中的作用构建突变株系。GmGT-2F/GmAGAL双突变或GmAGAL单突变导致的功能缺失均会减少油体的形成这与种子含油量的生化测定结果一致。这些结果表明GmGT-2F通过GmAGAL正向调控大豆种子的含油量和脂肪酸组成。此外还在gmgt-2f/gmagal双突变体和gmagal单突变体中测定了α-半乳糖苷酶活性。与野生型相比gmgt-2f/gmagal和gmagal突变体中的α-半乳糖苷酶活性均显著降低且单突变体与双突变体之间未观察到显著差异图5I。这些发现表明GmGT-2F和GmAGAL同时突变以及GmAGAL单独突变均会影响植物体内的α-半乳糖苷酶活性。这些结果表明GmAGAL位于GmGT-2F的下游发挥作用且GmGT-2F通过增强依赖于GmAGAL的α-半乳糖苷酶活性来促进大豆种子中的油脂积累。图5: GmAGAL与GmGT-2F/GmAGAL基因敲除可降低转基因大豆种子油含量07 GmCYP2可与GmGT-2F相互作用为了进一步表征GmGT-2F研究进行了酵母双杂交以鉴定潜在的相互作用蛋白。调节植物生长发育的GmCYP2Glyma.12G024700是与GmGT-2F相互作用的有力候选者。为了验证互作研究开展了一系列体外和体内实验。这些结果表明GmGT-2F在体外和体内均与 GmCYP2发生相互作用。组织特异性表达、亚细胞定位和双荧光素酶报告基因检测显示GmCYP2与 GmGT-2F发生物理相互作用并抑制其对靶基因的转录激活。图6GmGT-2F与GmCYP2存在物理相互作用08 GmGT-2F、GmCYP2和GmAGAL的自然变异为了探究可用于大豆育种的自然等位基因变异研究基于启动子单核苷酸多态性SNPs、插入/缺失InDels以及两个非同义外显子SNP对547份种质资源中的GmGT-2F基因进行了单倍型分析。结果共鉴定出三种单倍型其中Hap1和Hap2与较高的含油量相关而Hap3则显示出较高的蛋白含量图7A。为了评估这些GmGT-2F单倍型Hap1、Hap2和Hap3之间的功能差异研究进行了双荧光素酶报告基因检测结果表明GmGT-2F启动子的变异并不驱动功能分化。鉴于启动子单倍型不影响转录研究重点转移到了编码区的两个非同义突变上编码区的C-to-APro-to-His变异可能是GmGT-2F功能分化的驱动因素。研究还评估了互作基因GmCYP2中由四个SNP定义的三种单倍型。Hap2和Hap3与较高的含油量相关而Hap1显示出较高的蛋白含量图7B。下游基因GmAGAL启动子区域的单倍型分析揭示了三种启动子单倍型。与Hap1和Hap2相比Hap3与较高的含油量相关而Hap2则与较高的蛋白含量相关图7C。这些单倍型为优质大豆育种提供了新的遗传资源。图7大豆中GmGT-2F、GmCYP2和GmAGAL的等位基因多样性总的来说该研究鉴定出大豆三螺旋转录因子GmGT-2F通过直接激活GmAGAL基因表达提升α-半乳糖苷酶活性从而增加种子油含量并揭示其与GmCYP2的互作抑制机制为高油大豆育种提供新靶点。在这个研究中比较重要的一环整合RNA-seq差异基因分析和DAP-seqDNA结合位点测序筛选GmGT-2F直接靶点。在植物学研究中精准描绘转录因子的靶向调控网络往往是提升文章维度的“点睛之笔”。然而作为科研同路人我们深知各位老师在实际操作中面临的深深无奈植物体内的转录因子往往丰度极低且市面上极其缺乏高质量的植物专用 ChIP 级别抗体。这正是DAP-seq 技术能够在植物学领域大放异彩的原因——它完美绕过了抗体的限制直接利用体外表达的蛋白高效、精准地捕获全基因组的结合位点。DAP-seq作为新锐之选0抗体需求为转录调控量身打造。爱基百客DAP-seq物种经验已有180相关项目文章发表在Nature Communications、Plant Cell、Developmental Cell和plant physiology等高水平期刊。欢迎咨询~