做网站汉狮网络,网站开发后端菜鸟教程,怎样自己做企业的网站,景区网站建设策划书一、实验准备材料目的质粒、待转染的细胞、细胞培养基、无血清培养基、转染试剂、胰蛋白酶#xff08;胰酶#xff09;、磷酸盐缓冲液#xff08;PBS缓冲液#xff09;、抗生素#xff08;根据实验需求选择是否使用#xff09;、细胞培养皿或培养板。仪器细胞培养箱、超净…一、实验准备材料目的质粒、待转染的细胞、细胞培养基、无血清培养基、转染试剂、胰蛋白酶胰酶、磷酸盐缓冲液PBS缓冲液、抗生素根据实验需求选择是否使用、细胞培养皿或培养板。仪器细胞培养箱、超净工作台、离心机、移液器、显微镜、二氧化碳CO₂培养箱。二、实验步骤细胞准备转染前1天用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞随后用含有10%胎牛血清的完全培养基将细胞重悬并按照合适的密度接种到细胞培养皿或培养板中保证转染时细胞的汇合度达到70% - 90%。把接种好细胞的培养皿或培养板置于37°C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养过夜。转染复合物制备准备两支无菌离心管分别标记为A和B。在A管中加入适量无血清培养基再加入一定量的质粒DNA轻轻混合均匀。质粒的具体用量需依据细胞类型、转染试剂的说明书以及实验目的来确定通常范围是1 - 5μg。在B管中加入与A管等量的无血清培养基然后按照转染试剂的说明书加入相应体积的转染试剂轻轻混合均匀在室温下孵育5分钟。将A管中的DNA溶液逐滴加入到B管的转染试剂溶液中边加边轻轻混合均匀在室温下孵育15 - 30分钟让转染复合物充分形成。转染从细胞培养箱中取出细胞培养皿或培养板用磷酸盐缓冲液轻轻冲洗细胞2 - 3次以去除残留的血清。向细胞中加入适量无血清培养基使细胞完全被浸没接着将制备好的转染复合物逐滴加入到细胞培养皿或培养板中轻轻晃动培养皿或培养板使转染复合物均匀分布。把细胞放回37°C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养4 - 6小时。更换培养基转染4 - 6小时后从细胞培养箱中取出细胞吸去含有转染复合物的无血清培养基。向细胞中加入适量含有10%胎牛血清的完全培养基继续在37°C、含5% CO₂的细胞培养箱中培养。三、结果检测荧光观察适用于带有荧光标记的质粒转染24 - 48小时后使用荧光显微镜观察细胞统计发出荧光的细胞数量进而计算转染效率。蛋白检测如Western blot转染48 - 72小时后收集细胞提取总蛋白通过Western blot检测目的蛋白的表达水平以此分析转染效果。mRNA检测如RT - qPCR收集转染后的细胞提取总RNA将其反转录为cDNA后利用RT - qPCR检测目的基因mRNA表达量的变化。